器材和试剂
显微镜、接种环、酒精(jing)灯、载玻片、吸管、菌种、培养基、革兰染色液、生理盐水等。
原理：
1.革兰(lan)阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙(yi)醇不易透入；而革兰阴性菌细胞壁结构(gou)较疏松，肽聚糖层少，脂质(zhi)含量多，乙醇易(yi)渗入。
2.革兰阳(yang)性菌的等电点低（pI2～3），革兰阴性菌等电点较高(gao)（pI4～5），在相同pH条件下，革兰阳性菌(jun)所带阴电荷比革兰阴性菌(jun)多，与带正电荷的(de)结晶紫染料结合较牢固且不易(yi)脱色。
3.革(ge)兰阳性菌细胞内含有大量(liang)核糖核酸镁盐，可(ke)与结晶紫和碘牢固地结合(he)成大分子复合物，不易被乙醇(chun)脱色；而革兰阴性菌细胞内(nei)含极少量的核糖核(he)酸镁盐，吸附染(ran)料量少，形成的(de)复合物分子也较小，故易被乙醇脱(tuo)色。
操作方法：
1．细菌涂片标本的制作(zuo)
（1）涂片：取洁净载玻片(pian)一张，用玻璃铅笔于玻片(pian)上划个直径1.5cm左右的圆圈。用接种环在圆圈内各(ge)加1环生理盐水。接种环灭菌后(hou)，挑取细菌少许在盐水中磨匀，呈轻(qing)度混浊。涂好的菌膜大(da)小一般以1cm2左右为宜。每(mei)次取菌前后注意将接种(zhong)环灭菌。如果是液体培养(yang)物可直接涂抹于洁净的载玻(bo)片上。
（2）干燥：涂片最好在室温下自然干燥，或将标(biao)本面向上，置于酒精灯火焰(yan)高处慢慢烘干，切不可在火焰上烧(shao)干。
（3）固定：细菌的固定常用火(huo)焰加热法，即将上述已(yi)干的涂片在酒精灯火焰中通过3次。固(gu)定的目的在于杀(sha)死细菌，并使菌体与玻片(pian)粘附牢固，染色时不致(zhi)于被染液和水冲掉，同时固定可(ke)凝固细胞质，改变细菌对染料的通透(tou)性。
2.细菌涂片标本的染色
（1）初染：将结晶紫染液加于(yu)制好的涂片上，染色 1min，用细流水冲洗，甩去积水。
（2）媒染：加卢戈碘液作用1min，用细流水冲洗，甩去积水。
（3）脱色(se)：滴加95%酒精(jing)数滴，摇动玻片数秒钟，使(shi)均匀脱色，然后斜持玻片，再滴加酒精(jing)，直到流下的酒精无色为止（约0.5min），用细流水冲洗，甩去积水(shui)。
（4）复染：加稀释石炭酸复红染0.5min，用细流水(shui)冲洗，甩去积水。
待标(biao)本片自干或用吸水纸(zhi)吸干后，在涂片上滴加香柏油(you)，置油镜下观察。
结果(guo)判定：被染成紫色的细菌为(wei)革兰阳性菌；被染成(cheng)红色的细菌为革兰阴性(xing)菌。
com影响因素：
1.操作因素(su)：涂片太厚或太薄，固定时(shi)菌体过分受热，以及脱色时间长短，都(dou)会影响染色结果。
2.染液因素：所有染液应防(fang)止染液蒸发而改变浓度，特(te)别是卢戈碘液久存或(huo)受光作用后易失去媒染(ran)作用；涂片积水过多会改变染液浓度，影响染色效果，如脱色用的乙醇以95%为宜，浓度降低会增强其脱(tuo)色能力。
3.细菌因素(su)：细菌的菌龄不同，革兰染色结果(guo)也有差异，一般以18～24h的培养物染色效果最好，菌龄过长(chang)影响细菌染色性。
